导读：病*感染后免疫系统过度激化导致的"细胞因子风暴"是病*性肺炎由轻症向重症转换的重要原因，同时也是重症患者产生并发症的重要原因。该实验旨在寻求能有效抑制细胞因子的中成药，为病*性肺炎治疗提供科学依据。采用脂多糖（LPS）诱导RAW.7细胞建立体外炎症损伤模型，用Griess法检测细胞上清液中一氧化氮（NO）生成量，酶联免疫法检测细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-2、IL-6、IL-10分泌量，对收集的已上市中成药开展抑制炎症因子释放的研究。发现牛*清心丸（局方）、藿香正气软胶囊、牛*解*丸、穿心莲内酯滴丸等中成药对LPS诱导RAW.7细胞一氧化氮（NO）生成及细胞因子分泌均有显著抑制作用，提示这4种中成药具有抑制炎症因子活性。中成药牛*清心丸（局方）、藿香正气软胶囊、牛*解*丸、穿心莲内酯滴丸具有抑制"细胞因子风暴"作用，在防治重症肺炎中具有潜在的临床应用价值。
欢迎引用本文：
郭虹,蒲位凌,周昆,韩立峰,郝佳,常艳旭,高秀梅,王涛.中成药抑制巨噬细胞炎性细胞因子释放的体外研究[J].天津中医药,,37(10):-.
GUOHong,PUWeiling,ZHOUKun,HANLifeng,HAOJia,CHANGYanxu,GAOXiumei,WANGTao.StudyoftheeffectofmarketedChinesepatentmedicineoninhibitingreleaseofinflammatoryfactorsinmacrophagemodels[J].TianjinJournalofTraditionalChineseMedicine,,37(10):-.
中成药抑制巨噬细胞炎性细胞因子释放的体外研究
郭虹,蒲位凌,周昆,韩立峰,郝佳,常艳旭,高秀梅,王涛
（天津中医药大学中医药研究院，天津）
年底爆发的新型冠状病*肺炎（简称新冠肺炎，COVID-19）疫情，已在全世界百余国家和地区迅速传播，不但严重挤压医疗资源，更引起世界范围的恐慌。新型冠状病*感染以发热、干咳、乏力为主要表现，重症患者出现急性呼吸窘迫综合征及多器官衰竭等症状。《柳叶刀》上发表的1项研究指出，在危重患者中可见“细胞因子风暴”发生。新型冠状病*感染后，短时间内大量产生多种细胞因子，导致人体免疫系统功能的紊乱，造成严重机体损伤，这种极端的免疫攻击即称之为“细胞因子风暴”。新型冠状病*感染重症患者血浆白介素（IL）-6、IL-10等炎性细胞因子明显升高。有研究分析了例COVID-19病例的细胞免疫和细胞因子情况，观察到重症组IL-6升高的比例明显高于轻症组。这些数据均提示重症COVID-19患者存在炎性反应水平高的特点。
目前临床主要应用糖皮质激素平息细胞因子风暴，但糖皮质激素是一把“双刃剑”，除了引起骨质疏松的不良反应，其免疫抑制作用还会阻碍机体对病*的抵抗和清除，限制了它在COVID-19的应用。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病*感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》中强调“较大剂量激素会延缓对冠状病*的清除”。因此，寻找能有效干预和缓解细胞因子风暴的治疗药物，是目前防治COVID-19的迫切之需。
COVID-19属于中医“疫病”范畴，在数千年中华文明史上，中医药学对于瘟疫诊治积累了丰富的临床经验。对待新发病*疫情，如何结合传统中医理论防治疫病，发挥中医药防疫抗病能力成为中医药人的重要课题。目前中成药品种在药效物质、工艺品质等方面都有系统深入的研究，质量稳定，工艺可靠。从已有中药中发现有活性药物用于疫情防治方面具有临床转化快速、使用安全性强等突出优势。本研究收集了60余种市场在售中成药，从中药抑制细胞因子风暴角度入手，采用脂多糖（LPS）诱导RAW.7细胞建立体外炎症模型，考察药物对一氧化氮（NO）生成和细胞因子释放的抑制作用，为寻找能降低病*感染所致细胞因子风暴水平的中成药提供研究基础。
1实验部分1.1仪器与材料
二氧化碳（CO2）培养箱，美国Thermo公司；IX53倒置相差显微镜，日本Olypums公司；Spark多功能酶标仪，瑞士Tecan司；RAW.7小鼠巨噬细胞株购自ATCC（SC-）；LPS，美国Sigma公司；细胞活力检测试剂盒、NO检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒，美国RD公司；小鼠多因子炎性因子检测试剂盒，美国MesoScaleDiscovery公司；二甲基亚砜（DMSO），北京索莱宝科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、双抗，均为美国Gibco公司；乙醇为分析纯，天津康科德科技有限公司。
1.2中成药提取
收集的上市中成药均经粉碎（喷雾剂使用原料）后以10倍70%乙醇溶液（W/V）进行30min超声提取，以g离心10min，离心半径18cm，取上清液于40℃减压浓缩干燥。干燥粉末以DMSO配制为50mg/mL浓度备用。
1.3细胞培养
RAW.7细胞培养于含10%热灭活胎牛血清的DMEM培养液中。待细胞处于对数生长期，加入胰蛋白酶消化，形成单细胞悬液转移至离心管中，r/min离心5min，离心半径14.5cm，弃上清，加入培养液细胞计数后，接种于新的培养瓶内，放置于5%CO2、37℃培养箱中培养。
1.4细胞活力检测
收集对数生长期的RAW.7细胞，按1×/mL密度接种于96孔板。48h后分别加入不同中成药提取物。加药处理24h后，取出培养板，吸去上清液，每孔加入μL稀释的CCK-8溶液，37℃孵育30min，酶标仪于nm处检测吸光度（A值）。
1.5Griess法检测NO
将RAW.7细胞以1×/mL密度接种于96孔板，48h后分组处理细胞。空白组不做任何处理；模型组加入终浓度1μg/mLLPS诱导炎症；药物处理组分别用不同中成药提取物和LPS共同孵育，24h后收集细胞上清液，按照试剂盒说明书分别加入GriessReagentⅠ和Ⅱ，酶标仪于nm处测定吸光度，用标准品溶液的吸光度与浓度做标准曲线，计算各样品处理细胞上清液中NO的浓度。
1.6细胞因子检测
分组及处理方法同1.5，收集细胞上清液待测。一部分上清液稀释后按ELISA试剂盒操作说明，检测TNF-α含量。一部分上清液按照小鼠多因子炎性因子检测试剂盒说明书操作，用稀释液进行1:1稀释后检测炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10等的含量。以各中成药提取物的高剂量抑制率做雷达图，抑制率（%）=（模型组-给药组）/（模型组-空白组）×%。
1.7统计方法
使用SPSS20.0软件包进行分析，实验数据以均数±标准差（xˉ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），组间两两比较，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’sT3法，P0.05时认为具有统计学差异。
2结果2.1中成药对RAW.7细胞活力的影响
首先采用CCK-8法检测不同中成药提取物在50μg/mL时对正常RAW.7细胞活力的影响。结果显示，牛*清心丸（局方）（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂）提取物在50μg/mL时对正常RAW.7细胞活力无影响，而藿香正气软胶囊（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂）、牛*解*丸（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂）、穿心莲内酯滴丸（天士力医药集团股份有限公司）3个中成药提取物在50μg/mL时对RAW.7细胞活力有明显抑制作用。
因此进一步降低药物浓度，考察藿香正气软胶囊、牛*解*丸、穿心莲内酯滴丸3个中成药提取物在25μg/mL对RAW.7细胞活力的影响。结果显示，藿香正气软胶囊、牛*解*丸、穿心莲内酯滴丸3个中成药提取物在25μg/mL剂量下对正常培养RAW.7细胞活力均无影响，见图1。
2.2中成药对NO生成的抑制作用
选用LPS诱导RAW.7细胞复制体外炎症损伤模型，考察药物对NO生成量的抑制作用。结果显示，与空白组比较，模型组NO生成显著增加，说明LPS诱导炎症模型成功；与模型组比较，牛*清心丸（局方）、藿香正气软胶囊、牛*解*丸、穿心莲内酯滴丸均能显著抑制LPS诱导RAW.7细胞NO生成量，提示以上药物可能具有抗炎作用，见图2。
2.3中成药对细胞因子分泌的调节作用
细胞因子失衡可引发炎症级联反应、是导致全身性免疫失调的重要因素，本研究利用LPS诱导的RAW.7细胞炎症模型，在各中成药有效抑制NO的剂量下，考察了药物对多种细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10）分泌的调节作用。实验结果表明，LPS引起TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10分泌升高，牛*清心丸（局方）、藿香正气软胶囊、牛*解*丸、穿心莲内酯滴丸的高剂量组均能显著抑制LPS诱导的细胞因子生成，见表1。为将多因子的药效结果可视化，采用雷达图表示不同药物的综合效果。雷达图中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10为5个维度，最外维表示抑制率%，越靠近中心点表示抑制率越低。综合药效以穿心莲内酯滴丸最明显，其他药物对各细胞因子有不同程度的抑制作用，见图3。
3讨论
病*性肺炎是一种由病*感染引起的急性呼吸道传染病，由上呼吸道向下蔓延引发肺部炎症，导致肺换气功能障碍。研究显示，呼吸道病*感染常导致机体的细胞因子水平异常，重症患者血浆中IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等细胞因子显著增高，形成“细胞因子风暴”。“细胞因子风暴”反应主要发生在肺部的血管壁内皮细胞，感染可能会导致大量免疫细胞向肺部集中，同时使肺部血管通透性增大，可导致肺炎、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、呼吸衰竭、休克等症状，严重者可能导致死亡。
自严重急性呼吸综合征（SARS）疫情爆发以来，“细胞因子风暴”就引发高度